Fundação Ziehl-Neelsen Stain, Reagentes e Técnica

O Mancha de Ziehl-Neelsen em uma técnica de coloração para identificar microorganismos resistentes ao álcool e ácido (AAR). O nome desse procedimento de microbiologia refere-se a seus autores: o bacteriologista Franz Ziehl e o patologista Friedrich Neelsen.

Essa técnica é um tipo de coloração diferencial, que implica o uso de diferentes corantes para criar contraste entre as estruturas que você deseja observar, diferenciar e posteriormente identificar. A mancha de Ziehl-Neelsen serve para identificar certos tipos de microorganismos.

Alguns desses microrganismos são micobactérias (por exemplo,Mycobacterium tuberculosis), nocardias (por exemplo,Nocardia sp) e alguns parasitas unicelulares (por exemplo,Cryptosporidium parvum). Muitas das bactérias podem ser classificadas através de uma técnica comum chamada coloração de Gram.

No entanto, alguns grupos bacterianos exigem outros métodos para identificá-los. Técnicas como a coloração de Ziehl-Neelsen exigem combinações de corantes com calor para fixar a primeira à parede celular.

Em seguida, vem um processo de descoloração que permite dois resultados: resistência ou sensibilidade à descoloração por ácidos e álcoois.

Índice

• 1 Fundação
  • 1.1 Coloração Secundária
• 2 reagentes
  • 2.1 Coloração primária
  • 2,2 solução de descoloração
  • 2.3 Coloração secundária (anti-corante)
• 3 técnica
  • 3.1 Procedimento de coloração ácido-rápido
• 4 referências

Fundação

A base desta técnica de coloração baseia-se nas propriedades da parede celular desses microrganismos. A parede é formada por um tipo de ácidos graxos chamados ácidos micólicos; Estes são caracterizados por cadeias muito longas.

Quando os ácidos graxos têm estruturas muito longas, eles podem reter os corantes com mais facilidade. Alguns gêneros de bactérias são muito difíceis de corar pela coloração de Gram, devido ao alto teor de ácido micólico da parede celular.

Na coloração de Ziehl-Neelsen, é utilizado o composto fenólico carbol fucsina, um corante básico. Isto tem a capacidade de interagir com ácidos graxos na parede celular, que é cerosa na textura à temperatura ambiente.

A coloração com carbol fucsina é melhorada na presença de calor, porque a cera se funde e as moléculas de corante se movem mais rapidamente para a parede celular.

O ácido que é usado mais tarde serve para descolorir as células que não foram coradas porque a parede delas não estava suficientemente relacionada com o corante; portanto, a força do descolorante ácido é capaz de remover o corante ácido. As células que resistem a essa descoloração são chamadas de resistentes a ácidos.

Coloração secundária

Após a descoloração da amostra, isso é contrastado com outro corante chamado corante secundário. Azul de metileno ou verde malaquita é geralmente usado.

O corante secundário mancha o material de fundo e, consequentemente, cria contraste com as estruturas que foram tingidas no primeiro passo. Apenas as células branqueadas absorvem o segundo corante (anti-mancha) e obtêm sua cor, enquanto as células de ácido-rápido retêm a cor vermelha.

Este procedimento é freqüentemente usado para a identificação de Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, que são chamados de bacilos álcool-ácido.

Reagentes

Coloração primária

Carboxin 0,3% fucsina (filtrada) é usado. Este corante é preparado a partir de uma mistura de álcoois: fenol em etanol (90%) ou metanol (95%), e nesta mistura são dissolvidos 3 gramas de fucsina básica.

Solução de descoloração

Neste passo, soluções de 3% de ácido de álcool ou 25% de ácido sulfúrico podem ser usadas.

Coloração secundária (anti-corante)

O corante mais comumente usado para realizar o contraste nas amostras é geralmente 0,3% de azul de metileno. No entanto, você também pode usar outros, como 0,5% verde malaquita.

Técnica

Procedimento de coloração ácido-rápido

Prepare um esfregaço bacteriano

Esta preparação é feita em um slide limpo e seco, seguindo as precauções de esterilidade.

Secando o esfregaço

Deixe o esfregaço secar à temperatura ambiente.

Aquecer a amostra

A amostra deve ser aquecida, aplicando fogo ao slide abaixo. A fixação com álcool pode ser feita quando o esfregaço não foi preparado com escarro (tratado com hipoclorito de sódio para clarear) e se não for corado imediatamente.

M. tuberculosis É eliminado com lixívia e durante o processo de coloração. O ajuste de calor do escarro não tratado não matará M. tuberculosis, enquanto a fixação com álcool é bactericida.

Cubra a mancha

A mancha é coberta com a solução de carbol fucsina (coloração básica primária).

Aquecer a mancha

Isso é feito por 5 minutos. Você deve notar uma liberação de vapor (aproximadamente 60 ° C). É importante não sobreaquecer e evitar queimar a amostra.

Com relação ao aquecimento da mancha, muito cuidado deve ser tomado ao aquecer o carbol fucsina, especialmente se a coloração for realizada em uma bandeja ou outro recipiente no qual produtos químicos altamente inflamáveis ​​da coloração anterior tenham sido coletados.

Apenas uma pequena chama deve ser aplicada sob as lâminas usando um cotonete iluminado previamente umedecido com algumas gotas de álcool ácido, metanol ou etanol a 70%. Evite usar um cotonete embebido em etanol, porque isso é um risco de incêndio.

Lave a mancha

Esta lavagem deve ser feita com água limpa. Se a água da torneira não estiver limpa, lave o esfregaço com água filtrada ou destilada, de preferência.

Cubra o esfregaço com álcool ácido

Este álcool ácido deve estar a 3%. A cobertura é realizada por 5 minutos ou até que o esfregaço esteja descolorido o suficiente, ou seja, rosa pálido.

Deve-se levar em conta que o álcool ácido é inflamável; portanto, deve ser usado com muito cuidado. Evite estar perto de fontes de ignição.

Lave a mancha

A lavagem deve ser feita com água limpa e destilada.

Cubra o esfregaço com corante

Pode ser verde malaquita (0,5%) ou azul de metileno (0,3%) corante por 1 ou 2 minutos, usando o tempo mais longo se o esfregaço for fino.

Lave a mancha

Novamente, deve-se usar água limpa (destilada).

Drenar

A parte de trás da lâmina deve ser limpa e a mancha deve ser colocada em uma prateleira de drenagem, para que seja seca ao ar (não use papel absorvente para secar).

Examine o esfregaço sob o microscópio

A objetiva de 100X e o óleo de imersão devem ser usados. Escaneie o esfregaço sistematicamente e anote as observações relevantes.

Interpretar os resultados

Teoricamente, os microrganismos que são tingidos de uma cor avermelhada são considerados positivos em ácido-rápido (AAR +).

Pelo contrário, se os microorganismos estiverem manchados de azul ou verde, dependendo do corante usado como contra-corante, eles são considerados ácidos negativos resistentes ao álcool (AAR-).

Referências

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essenciais da Microbiologia Prática (1ª ed.) Editores médicos de Jaypee Brothers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiologia com Doenças pelo Sistema do Corpo (4ª ed.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Microbiologia Introdutória (1ª ed.) Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. e Morton, V. (2006). Manual de Laboratório e Livro de Exercícios em Microbiologia: Aplicações ao Tratamento do Paciente (11a ed.). Educação McGraw-Hill.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Livro de Microbiologia (1ª ed.) B.I. Publicações PVT.